La adhesión diferencial como mecanismo motor de la epibolia de blastomeras profundas en peces teleosteos anuales

Abstract

La gastrulación involucra una serie de movimientos celulares coordinados quetransforman una blástula poco estructurada en un embrión multilaminar. El primer movimiento celular que ocurre durante el desarrollo temprano de peces teleósteos es la epibolia de las células del blastodermo. Durante este movimiento, el blastodenno profundo se angosta y dispersa en dirección hacia el polo vegetal hasta cubrir completamente a lacélula vitelina. A partir de los estudios iniciales realizados por Ray Keller en Xenopus laevis, se ha sugerido que la intercalación radial es el mecanismo motor que explica la expansión y dispersión del blastodermo profundo durante la epibolia. Si bien Warga yKimmel han sugerido que algo similar podría estar operando en pez cebra, recientemente se ha demostrado que e-cadherina juega un papel esencial durante la epibolia en este pez teleósteo. Ensayos de pérdida de función o utilización de embriones mutantes para este gen muestran un retardo específico en la epibolia de las blastómeras profundas como consecuencia de una intercalación radial deficiente. Ensayos de hibridación in situ muestran que el ARN mensajero (ARNm) de e-cadherina está presente en bajos niveles de expresiónen las capas profundas y alto en las capas más superficiales del blastodermo. Esto sugiere la posibilidad de que la expansión planar del blastodermo durante la epibolia sea el resultado del movimiento unidireccional de las blastómeras desde la profundidad hacia la superficie, favorecido por un gradiente diferencial de expresión de E-Cadherina en el eje radial del embrión. En este contexto, la intercalación radial no sería el motor de la epibolia deblastómeras profundas sino más bien la consecuencia de la adhesión diferencial aplicada a grandes masas de células. Si ese fuera el caso, en condiciones de intercalación radial nula, la adhesión cumpliría un papel principal. Durante este proyecto decidimos investigar laparticipación de la adhesión mediada por Cadherinas durante la epibolia en A. nigripinnis utilizando un modelo que presenta 2 ventajas principales: (i) la epibolia se encuentra separada espacio-temporalmente de la gastrulación y (ii) la densidad de células es baja, locual excluye a la intercalación radial como mecanismo motor. Utilizando análisis morfológico en este pez teleósteo encontramos que durante la epibolia, las blastómeras profundas tienen una preferencia de adhesión por las células de la capa envolvente, las cuales utilizan como sustrato de migración. Esta preferencia sólo es significativa durante la epibolia y desde el punto de vista mecanístico la interacción se vefavorecida por un aplanamiento leve de las blastómeras profundas sumada a unadeformación local en las células de la capa envolvente. Además pudimos confirmar que las blastómeras profundas se ubican de manera preferencial en regiones cercanas a los bordes de las células de la capa envolvente durante la segregación y expansión epibólica. Mediante experimentos de hibridación in situ e inmunofluorescencia indirecta pudimos demostrar la expresión de al menos 2 Cadherinas presentes durante toda laepibolia. Mediante alineamientos de secuencia pudimos confirmar que las mismas corresponderían a los ortólogos de E- y N-Cadherina de A. nigripinnis. Desde el punto de vista funcional pudimos demostrar que E-Cadherina resulta esencial para la epibolia de lasblastómeras profundas. Ensayos de pérdida de función mediante microinyección demorfolinos o una versión dominante negativo de la proteína alteran de manera significativa la expansión y segregación de estas células durante la epibolia. La disminución de la interacción entre las blastómeras profundas y las células de la capa envolvente observadas en estos embriones probablemente explique este fenotipo. Tal como es de esperar para este tipo de moléculas, la funcionalidad de E-Cadherina responde a un mecanismo celular autónomo. De manera interesante pudimos demostrar que N-Cadherina es necesaria para el correcto establecimiento de la capa sincicial vitelina y como regulador de polaridad celular. Los ensayos de pérdida de función por microinyección de morfolinos generan alteraciones en el número y la forma de los núcleos de la capa sincicial. Mas aún, en algunos casoshemos encontrado alteraciones en el número de núcleos presente en las blastómeras profundas. Si bien la pérdida de función de N-Cadherina parece afectar la segregación de las blastómeras profundas, el mecanismo es diferente al observado para E-Cadherina, ypodría estar relacionado a alteraciones en la polaridad de las mismas.Con estos resultados pudimos demostrar que en ausencia de intercalación radial, la adhesión celular mediada por Cadherinas resulta esencial para la correcta expansión y segregación de las blastómeras profundas durante la epibolia en A. nigripinnis.