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dc.contributor.advisorLatorre, Ramón
dc.creatorOrio, Patricio
dc.date.accessioned2019-01-03T15:32:42Z
dc.date.available2019-01-03T15:32:42Z
dc.date.issued2004es_CL
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/10533/232857
dc.description.abstractThe high conductance, calcium-activated potassium (MaxiK) channel is widely expressed among mammalian tissues. The activity of the channel is increased by membrane depolarization and by increases in intracellular calcium concentration. The channel is assembled in the membrane as a homotetramer of its pore-forming α-subunit –coded by the Slo gene– and in some tissues its properties are modified by the presence of accessory proteins called β-subunits. Four β-subunits have been cloned in mammals, named β1 to β4. β1-subunit increases the apparent calcium sensitivity of the channel and slows down its activation and deactivation kinetics. It also allows the channel to be activated by 17-β-estradiol. In the presence of the β2-subunit the channel shows a fast inactivation process, which is removed by deleting the N-terminus of the protein. The β2-subunit without the fast inactivation domain (β2IR) has similar effects as the β1 subunit,increasing the apparent calcium sensitivity of the channel. The objective of this thesis work is to define molecular basis for the interaction of β1- and β2-subunits with the MaxiK channel, related to the modulation of the calcium- and voltage sensitivity and to the activation of the channel by estrogens. Heterologous expression systems were used to study several activation parameters of the MaxiK channel, alone or in combination with the β1- and β2IR-subunits.The data were analyzed in the context of an allosteric activation model that has been proposed for the MaxiK channel. The results indicate that the increase of the apparent calcium sensitivity in the presence of both β-subunits can not be explained by an increase in the affinity o the calcium binding sites. Instead, the β1- and β2-subunits increase the functional coupling between calcium binding and channel opening. An increase of the functional coupling between voltage sensor activation and channel opening was also observed, with some quantitative differences between both β-subunits. Therefore, β1- and β2-subunits must –directly or indirectly– interact with the domains of the α-subunit responsible for this functional coupling. For the voltage-activation, these are the linkers between the S4 and S5 transmembrane domains; whereas for the calcium-activation, these are the linkers between the S6 domain and the RCK domain –a domain adjacent to the inner mouth of the conduction pathway and that has been proposed to control the open-close state of the pore. The β1-subunit also decreases the voltage-dependence of the voltage sensor of the channel, located in the S4 segment of the α-subunit. This effect was not observed in the presence of the β2IR subunit. The transition between closed and open states of the channel has intrinsic voltage dependence, unrelated to voltage sensor movement, whose molecular nature is unclear. However, none of the β-subunits affected this process. Channel activation by 17-β-estradiol (17βE) and Tamoxifen (Tx) was studied in the absence and presence of different β-subunits. 5 μM 17βE activates the channel only in the presence of the β1- or β4-subunits, but not in their absence of in presence of β2- or β2IR-subunits. The antiestrogen Tx has different effects depending on concentration. When the concentration is lower than 1 μM, Tx activates the channel but only in the presence of the β1-subunit. When the Tx concentration is higher than 1 μM, there is an inhibition of MaxiK currents independent of the presence of any β-subunit. These results show that there are main differences in the pharmacology of MaxiK channel activation by estrogens and the pharmacology of the nuclear estrogen receptor. On the other hand, Tx, would have two interaction sites with the channel: an inhibition site present in the α-subunit and an activation site expressed only in the presence of the β1-subunit. In order to define functional domains in the β-subunits, the extracellular domains of the β1- and β2IR-subunit were exchanged, and the resulting quimerical β-subunits were studied. The effects of the quimerical β-subunits showed that all the differences between β1- and β2IR-subunits can be completely associated to the transmembrane and/or intracellular domains. This raises the conclusion that the transmembrane and/or intracellular domains of the β1-subunit interact with the voltage sensor of the channel, though a role of this domains on the other effects of the β-subunits is not discarded. Moreover, the transmembrane and/or intracellular domains of the β1-subunits are also needed for the activation of the channel by 17βE. All these results are an important step towards the molecular definition of the interaction networks between α- and β-subunits of the MaxiK channel.es_CL
dc.description.abstractEl canal de potasio activado por calcio de alta conductancia MaxiK está presente en casi todos los tejidos de mamíferos. La actividad del canal aumenta con incrementos del calcio intracelular y la despolarización de la membrana celular. El canal se forma como un homotetrámero de su subunidad α –una proteína codificada por el gen Slo– y en algunos tejidos las propiedades biofísicas del canal son modificadas por la presencia de proteínas accesorias llamadas subunidades β. En mamíferos se conocen 4 subunidades β, denominadas β1 a β4. La subunidad β1 aumenta la sensibilidad aparente a calcio del canal y hace más lenta la cinética de activación y de desactivación. Además, permite la activación del canal por 17-β-estradiol. En presencia de la subunidad β2 el canal muestra un proceso de inactivación rápida, que se puede remover eliminando el extremo N-terminal de la proteína. La subunidad β2 sin dominio de inactivación (subunidad β2IR) tiene sobre el canal efectos similares a los de la subunidad β1, aumentando su sensibilidad a calcio. El objetivo de esta tesis es definir bases moleculares para la interacción de las subunidades β1 y β2 con el canal MaxiK, en relación a la modulación de la sensibilidad a calcio y potencial y a la activación del canal por estrógenos. Se utilizaron sistemas de expresión heteróloga para estudiar distintos parámetros de activación del canal MaxiK, solo o en combinación con las subunidades β1 ó β2IR. Los datos fueron analizados en el contexto de un modelo alostérico de activación por calcio y potencial que ha sido recientemente propuesto para el canal MaxiK. Los resultados indican que el aumento de la sensibilidad aparente a calcio que se observa en presencia de ambas subunidades β no se explica por un aumento en la afinidad de los sitios de unión del catión. Más bien, las subunidades β incrementan el acoplamiento funcional entre la unión de calcio y la apertura del canal. También se observó un aumento del acoplamiento funcional entre la activación de los sensores de potencial y la apertura del canal, aunque con diferencias cuantitativas entre ambas subunidades β. Por lo tanto, ambas subunidades β interactuarían directa o indirectamente con los dominios de la subunidad α que llevan a cabo este acoplamiento funcional. En el caso de la activación por potencial, éstos son los lazos entre los segmentos de transmembrana S4 y S5; mientras que en el caso de la activación por calcio, sería el lazo entre el segmento S6 y el dominio denominado RCK –un dominio adyacente a la boca interna de la vía de conducción y que se ha propuesto como un controlador de la apertura y cierre del canal. Por otra parte, la subunidad β1 disminuye la dependencia de potencial del sensor de potencial del canal, ubicado en el segmento S4 de la subunidad α. Este efecto no se observó en presencia de la subunidad β2IR. La transición entre los estados cerrados y abiertos en el canal MaxiK tiene una dependencia intrínseca de potencial que no está asociada al movimiento de los sensores y cuya naturaleza molecular no es clara. Sin embargo, ninguna de las subunidades β afecta este proceso. Se estudió la activación del canal por 17-β-estradiol (17βE) y Tamoxifeno (Tx) en presencia y ausencia de distintas subunidades β. 17βE 5 μM activa al canal MaxiK en la presencia de las subunidades β1 y β4 pero no en su ausencia ni en la presencia de las subunidades β2 o β2IR. El antiestrógeno Tx tiene efectos distintos dependiendo de la concentración. A concentraciones menores de 1 μM, Tx activa al canal pero sólo en presencia de la subunidad β1. Cuando la concentración de Tx es mayor que 1 μM se observa una inhibición de las corrientes del canal MaxiK que es independiente de la presencia de cualquier subunidad β. Estos resultados indican que la farmacología de la activación del canal por estrógenos tiene importantes diferencias con la farmacología del receptor nuclear de estrógenos. Por otra parte, Tx tendría dos sitios de interacción con el canal: un sitio de inhibición presente en la subunidad α y un sitio de activación que se expresa sólo en la presencia de la subunidad β1. Para definir dominios funcionales en las subunidades β, se estudiaron dos subunidades β quiméricas que resultan del intercambio de los dominios extracelulares de las subunidades β1 y β2IR. El estudio de los efectos de dichas quimeras sobre el canal mostró que las diferencias entre las subunidades β1 y β2IR se asocian por completo a los dominios de transmembrana y/o intracelulares. Esto permite concluir que los dominios de transmembrana y/o intracelulares de la subunidad β1 interactúan con el sensor de potencial del canal, y no se descarta que estos dominios sean también responsables de los otros efectos de las subunidades β. Además, se necesitan los segmentos de transmembrana y/o intracelulares de las subunidad β1 para el efecto activador de 17βE. Todos estos resultados son un importante paso hacia la definición molecular de las redes de interacción entre las subunidades α y β del canal MaxiK.es_CL
dc.relationinstname: Conicyt
dc.relationreponame: Repositorio Digital RI2.0
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/openAccesses_CL
dc.titleModulation of the MaxiK Potassium Channel by the Coexpression of its β1 and β2 subunitses_CL
dc.titleMODULACIÓN DEL CANAL DE POTASIO MAXIK POR LA COEXPRESIÓN DE SUS SUBUNIDADES β1 Y β2es_CL
dc.titleModulatión of the maxik potassium channel by the coexpressión of its β1 and β2 subunits
dc.titlemodulación del canal de potasió maxik por la coexpresión de sus subunidades β1 y β2
dc.typeTesis Doctorado
dc.contributor.institutionUNIVERSIDAD DE CHILEes_CL
dc.identifier.folio198045es_CL
dc.country.isoChilees_CL
dc.description.conicytprogramPFCHA-Becas
dc.relation.projectidinfo:eu-repo/grantAgreement//198045es_CL
dc.relation.projectidinfo:eu-repo/grantAgreement//Beca Conicyt Doctorado Nacionales_CL
dc.relation.setinfo:eu-repo/semantics/dataset/hdl.handle.net/10533/93488
dc.rights.driverinfo:eu-repo/semantics/openAccess
dc.type.driverinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesises_CL
dc.description.shortconicytprogramPFCHA-Becas
dc.type.tesisTesis
dc.subject.oecd1nCiencias Naturaleses_CL
dc.subject.oecd2nOtras Ciencias Naturaleses_CL
dc.type.openaireinfo:eu-repo/semantics/publishedVersion


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