ABL inhibition activates TFEB and promotes cellular clearance in the lysosomal storage disorder Niemann-pick type C.

Abstract

Los lisosomas son organelos celulares que juegan un rol fundamental en la homeostasis celular al estar involucrados en procesos tales como: la reparación de la membrana plasmática, la degradación y el reciclaje de nutrientes, el metabolismo de macromoléculas y la autofagia. Deficiencias en proteínas lisosomales generan la acumulación de diversos tipos de moléculas en este organelo y son la causa de diferentes enfermedades lisosomales, tales como Niemann-Pick tipo C (NPC), la cual se caracteriza por presentar acumulación de colesterol lisosomal debido a mutaciones en los genes que codifican para las proteínas NPC1 ó NPC2. Interesantemente, en el último tiempo se ha descrito al factor de transcripción EB (TFEB) como el regulador maestro de la biogénesis lisosomal y de la expresión de genes involucrados en la autofagia. La actividad de TFEB y su translocación al núcleo depende de su estado de fosforilación en las serinas 211 y 142, las que son fosforiladas principalmente por la serina/treonina quinasa mTORC1. En condiciones basales, TFEB está fosforilado en las serinas mencionadas anteriormente y se mantiene en el citoplasma debido a su acoplamiento a la chaperona citosólica 14-3-3. En nuestro laboratorio se ha descrito previamente la activación de la tirosina quinasa ABL en la enfermedad NPC. La inhibición de ABL usando Imatinib, un inhibidor específico de la quinasa, previene la muerte neuronal en el cerebelo, y promueve una mejora de las habilidades motoras y la sobrevida de los ratones modelo de la enfermedad. Adicionalmente, se ha descrito que el uso de inhibidores farmacológicos de ABL inducen el flujo autofágico y el incremento en la cantidad de lisosomas. Sin embargo, el mecanismo celular por el cual la inhibición de ABL estaría induciendo estos cambios aún se desconoce. Tomando en cuenta esta información y resultados preliminares, nos planteamos la siguiente hipótesis: “La señalización de ABL promueve la localización citoplasmática de TFEB inhibiendo la limpieza celular y contribuyendo a la patogenia de la enfermedad lisosomal de Niemann-Pick C”. Para corroborar nuestra hipótesis, primero evaluamos la translocación de TFEB al núcleo mediante la técnica de high-content screening utilizando distintos inhibidores de ABL. Encontramos que la inhibición de ABL mediante distintos inhibidores promueven la translocación de TFEB al núcleo. Encontramos los mismos resultados mediante fraccionamiento núcleo citoplasma, y al evaluar TFEB endógeno. Adicionalmente, al utilizar un siRNA contra ABL1 observamos el mismo fenómeno de translocación al núcleo y un incremento de la expresión de los genes blanco de TFEB. Estos resultados indican que la inhibición de ABL promueve la activación de TFEB. Luego, evaluamos procesos biólogiocos descritos rio abajo de la activación de TFEB en condiciones de inhibición de ABL. Observamos que la inhibición de ABL incrementa el flujo autofágico en células H4 que sobreexpresan establemente el plásmido LC3-GFP- mRFP. Además, la inhibición de ABL utilizando Imatinib o un siRNA contra ABL1, incrementó los niveles proteicos de los lisosomas, lo que fue evaluado siguiendo los niveles de LAMP1 y la tinción de lysotracker. Interesantemente, observamos que los lisosomas se acoplan a la membrana plasmática al inhibir ABL, sugiriendo un incremento en el proceso de exocitosis lisosomal. Estos resultados indican que el incremento tanto del flujo autofágico, la cantidad de lisosomas como la de exocitosis lisosomal, procesos regulados por la activación de TFEB, son eventos rio abajo de la inhibición ABL. Por otro lado, evaluamos si esta activación de TFEB por la inhibición de ABL era dependiente o independiente de mTORC1. Para ello, evaluamos los niveles de fosforilación de las serinas 142 y 211 de TFEB utilizando anticuerpos específicos para estas serinas fosforiladas. Encontramos que el inhibidor de ABL no produce cambios en los niveles de fosforilación de la serina 142, y si reduce los niveles en la serina 211 de TFEB. Evaluamos la actividad de mTORC1 analizando la fosforilación de proteínas blanco de mTORC1, y en forma coherente con los resultados anteriores observamos que inhibidores de ABL, Imatinib o Nilotinib, no generan cambios en la actividad de mTORC1. Estos resultados indican que la inhibición de ABL activa a TFEB independiente de la actividad mTORC1. Posteriormente, evaluamos si la tirosina quinasa ABL podría fosforilar en tirosina a TFEB. Mediante inmmunoprecipitación de TFEB y un ensayo de fosforilación in vitro, encontramos que la actividad de ABL es suficiente para promover un incremento en los niveles de fosforilación en tirosina de TFEB. Por otro lado, encontramos mediante mutaciones sitio dirigidas de TFEB que la tirosina 173 es relevante para mantener a TFEB en el citoplasma e impacta en los niveles fosforilación en S211. Nuestros resultados muestran por primera vez que ABL fosforila a TFEB en tirosina y que estas fosforilaciones son relevantes para su localización citoplasmática. Debido a que ABL fosforila a TFEB en tirosina y su inhibición promueve su translocación al núcleo, quisimos evaluar si esta vía de señalización tendría un impacto en la limpieza celular, un fenómeno regulado por TFEB. En distintos modelos celulares en los cuales primero se promovió la acumulación de colesterol lisosomal, observamos que la inhibición de ABL promueve la limpieza celular de este colesterol acumulado. Interesantemente, este fenómeno no ocurre al utilizar células nulas para TFEB, indicando que la inhibición de ABL promueve la limpieza celular a través de la activación de TFEB. Posteriormente, evaluamos si esta vía de señalización ABL/TFEB participa en la acumulación de colesterol lisosomal en modelos de la enfermedad lisosomal de NPC. Encontramos en fibroblastos de pacientes de NPC que la quinasa ABL está activa, y que su inhibición promueve tanto la reducción en la acumulación de colesterol como la translocación de TFEB al núcleo. Esto se correlacionó con un incremento en los niveles de lysotracker y Lamp1 y de la expresión de genes blanco de TFEB en fibroblastos de pacientes NPC tratados con Imatinib y Nilotinib. Finalmente, corroboramos mediante modelos in vivo de la enfermedad que la inhibición o ausencia de ABL promueve la reducción de acumulación de colesterol y la translocación de TFEB al núcleo en las neuronas de purkinje. En resumen, hemos encontrado una nueva vía de señalización que involucra a ABL y TFEB. La inhibición de ABL promueve la translocación de TFEB al núcleo, incrementando la expresión de genes lisosomales y promoviendo la limpieza celular de colesterol en modelos de la enfermedad de NPC. De esta manera, la inhibición de la vía de señalización ABL/TFEB emerge como un blanco terapéutico no sólo para NPC, sino que también para las diversas enfermedades en las que la función lisosomal se ve disminuida.

Lysosomes are cellular organelles that play a fundamental role in cellular homeostasis because they are involved in different process such as: membrane repair, degradation and recycling of nutrients, macromolecules metabolism and autophagy. Deficiencies in lysosomal proteins promote the accumulation of different molecules in the organelle causing multiples lysosomal diseases, such as Niemann-Pick type C (NPC), which is characterized by lysosomal cholesterol accumulation due to mutations in the genes encoding for the NPC1 and NPC2 proteins. Interestingly, in the last time the transcription factor EB (TFEB) has been described as the master regulator of lysosomal biogenesis and gene expression related to autophagy. The activity and nuclear translocation of TFEB depends on its phosphorylation status in serine 211 and 142, which are regulated by the serine/threonine kinase mTORC1. At basal conditions, TFEB is phosphorylated in these serines and is retained in the cytoplasm due to its attachment to the cytosolic chaperone 14-3-3. Previously, our lab described that the tyrosine kinase ABL is activated in NPC disease. The Inhibition of this kinase using Imatinib, an ABL specific inhibitor, prevents the neuronal death in the cerebellum and improves the locomotor function and survival of the NPC mice. In addition, it has been described that the use of pharmacological ABL inhibitors induces the autophagy flux and an increase in the lysosomal levels. Nevertheless, the cellular mechanism by which ABL inhibition induces these changes are still unknown. Considering this data, the hypothesis of this thesis is the following: “ABL signaling promotes TFEB cytoplasmic localization, inhibiting cellular clearance and contributing to the pathogenesis of the lysosomal storage disease Niemann-Pick type C”. To test our hypothesis, first we evaluated TFEB nuclear translocation by the high-content screening technique, using different ABL inhibitors. We found that ABL inhibition by these inhibitors promotes TFEB nuclear translocation. The same results were obtained analyzing nuclear-cytoplasmic fractions, as well as evaluating endogenous TFEB cellular localization. In addition, we observed the same results; TFEB nuclear translocation and an increase in the expression of TFEB target genes, using a siRNA against ABL1. These results indicate that ABL inhibition activates TFEB. Then, we evaluated TFEB downstream cell biological process in conditions of ABL inhibition. We observed that ABL inhibition increases the autophagy flux in the stable H4 LC3-GFP-mRFP cell line. In addition, the results show that ABL inhibition, using Imatinib or a siRNA against ABL1 increases Lamp1 lysosomal protein levels and lysotracker staining. In addition, we found that under ABL inhibition lysosomes are attached to the plasma membrane,, suggesting an increase in lysosomal exocytosis. Thus, our results support the idea that the increase in autophagy flux, quantity of lysosomes and lysosomal exocytosis, all of them biological process that are regulated by TFEB, are downstream events of ABL inhibition. On the other hand, we evaluated if TFEB activation induced by ABL inhibition is dependent or independent of mTORC1. To do that, we evaluated the phosphorylation levels in TFEB serine 142 and 211, using specific antibodies for them. We found that ABL inhibition does not change the levels of phosphorylated serine 142 and decreases the levels of phosphorylated serine 211 on TFEB. Due to these results, we then evaluated the activity of mTORC1 following the phosphorylation of an mTORC1 target protein. We found that the ABL inhibitors, Imatinib or Nilotinib, do not change the activity of mTORC1. These results demonstrate that ABL inhibition activates TFEB independent of mTORC1. Then, we assessed whether the tyrosine kinase ABL phosphorylates TFEB on tyrosine. Using TFEB immunoprecipitation and an in vitro phosphorylation assay, we found that the activity of ABL was enough to promote an increase in the TFEB tyrosine phosphorylation levels. Concordantly, site directed mutagenesis showed that TFEB tyrosine 173 is relevant for maintaining TFEB cytoplasmic localization and impact on the S211 phosphorylation levels. These results demonstrate that ABL phosphorylates TFEB on tyrosine and these phosphorylations are important to retain TFEB in the cytoplasm. Subsequently, because ABL phosphorylates TFEB on tyrosine and its inhibition promotes TFEB nuclear translocation, we asked if this signaling pathway could have a role in cellular clearance, a phenomena that is regulated by TFEB. The results show that in different models in which cholesterol accumulation was promoted, ABL inhibition promotes cellular clearance cholesterol accumulated in lysosomes. This clearance effect was not observed in TFEB knock out cells, demonstrating that ABL inhibition promotes cellular clearance in a TFEB dependent way. The next step was to evaluate if the ABL/TFEB signaling pathway was relevant in the NPC lysosomal disease, which is characterized by lysosomal cholesterol accumulation. Our data show that in fibroblast from NPC patients, ABL kinase is active, and its inhibition promotes a reduction in cholesterol accumulation and TFEB nuclear translocation. These results correlates with an increase in Lamp1 and lysotracker levels and in TFEB target gene expression, measured in fibroblast from NPC patients treated with the ABL inhibitors, Imatinib and Nilotinib. Finally, we corroborated using in vivo models of the disease, that the inhibition or absence of ABL promotes a reduction in cholesterol accumulation and TFEB translocation to the nucleus in the purkinje neurons. In summary, we found a novel-signaling pathway, which involves the ABL kinase and TFEB. The inhibition of ABL promotes TFEB nuclear translocation, increasing lysosomal gene expression and causing an increase in cellular clearance in NPC models. Therefore, inhibition of ABL/TFEB signaling pathway arises as a therapeutic target not only for NPC disease, but also for different diseases that are characterized by lysosomal dysfunction.