Participación de los receptores de inmunidad innata Dectina-2, Dectina-1 y TLR4 en la activación de las células presentadoras de antígeno de mamíferos inducida por hemocianinas de moluscos

Abstract

Las hemocianinas de moluscos son usadas como carriers/adyuvantes, así como un inmunoestimulante no específico en variados usos clínicos, gatillando la producción de citoquinas proinflamatorias en células presentadoras de antígeno (APCs) y dirigiendo la respuesta inmune hacia una polarización de linfocitos T helper tipo 1 (Th1) cuando son inoculadas en mamíferos. Una característica estructural significativa de las hemocianinas son sus patrones de glicosilación, ya que tienen una naturaleza multivalente como antígenos altamente manosilados. En nuestro grupo hemos demostrado anteriormente que las hemocianinas son internalizadas por las APCs a través de endocitosis mediada por receptores con proteínas que contienen dominios de lectina tipo-C, como el receptor de manosa (MR). Sin embargo, la contribución de otros receptores de inmunidad innata en las vías de señalización proinflamatorias gatilladas por las hemocianinas se desconoce. Por lo tanto, en esta tesis estudiamos la participación de los receptores Dectina-2, Dectina-1 y el receptor de tipo-Toll 4 (TLR4) en la activación de APCs murinas inducida por las hemocianinas de Megathura crenulata (KLH), Concholepas concholepas (CCH) y Fissurella latimarginata (FLH). Los resultados mostraron que estas hemocianinas se unieron a los receptores quiméricos de Dectina-2 y Dectina-1 in vitro, disminuyendo esta unión cuando estas glicoproteínas fueron desglicosiladas. Sin embargo, los efectos proinflamatorios inducidos por las hemocianinas en APCs derivadas de ratones knock-out (KO) para Dectina-2 y Dectina-1 fueron independientes de ambos receptores. Además, la fosforilación de la quinasa Syk, elemento central en la vía de señalización de Dectina- 2 y Dectina-1, no fue detectada en APCs wild-type (WT). Por otro lado, confirmamos la unión de las hemocianinas, en forma dependiente de sus glicosilaciones, al receptor quimérico de TLR4 in vitro. Interesantemente, DCs provenientes del ratón deficiente para la proteína MyD88-adapter-like (Mal), un adaptador río abajo de TLR4, fueron parcialmente activadas por FLH, sugiriendo un rol de la vía de TLR en el reconocimiento y activación de las APCs. La participación de TLR4 fue determinada usando un anticuerpo bloqueador de TLR4 en APCs WT, y también en DCs derivadas de la cepa murina C3H/HeJ (no funcional para este receptor) y macrófagos deficientes en TLR4. En todos estos cultivos, la secreción de citoquinas proinflamatorias inducida por las hemocianinas se vio disminuida en comparación con los controles respectivos. Adicionalmente, mostramos que KLH y FLH inducen la fosforilación de la quinasa ERK1/2, un evento clave en la vía de señalización de TLR4. En conjunto, estos resultados sugieren que TLR4 participa en la respuesta proinflamatoria mediada por las hemocianinas en APCs, el cual podría cooperar con el MR para desencadenar el efecto proinflamatorio benéfico que direcciona la respuesta inmune hacia un perfil Th1.

Mollusk hemocyanins have biomedical uses as carriers/adjuvants and nonspecific immunostimulants with beneficial clinical outcomes by triggering the production of proinflammatory cytokines in antigen-presenting cells (APCs) and driving immune responses toward type 1 T helper (Th1) polarization, when inoculated in mammals. Significant structural features of hemocyanins are their glycosylation patterns, so they have a multivalent nature as highly mannosylated antigens. We have previously shown that hemocyanins are internalized by APCs through receptor-mediated endocytosis with proteins that contain C-type lectin domains, such as mannose receptor (MR). However, the contribution of other innate immune receptors to the proinflammatory signaling pathway triggered by hemocyanins is unknown. Thus, we studied the roles of Dectin-2, Dectin-1, and Toll-like receptor 4 (TLR4) in the hemocyanin activation of murine APCs, using hemocyanins from Megathura crenulata (KLH), Concholepas concholepas (CCH) and Fissurella latimarginata (FLH). The results showed that these hemocyanins bound to chimeric Dectin-2 and Dectin-1 receptors in vitro; which significantly decreased when the glycoproteins were deglycosylated. However, hemocyanin-induced proinflammatory effects in APCs from Dectin-2 knock-out (KO) and Dectin-1 KO mice were independent of both receptors. Moreover, phosphorylation of Syk kinase, a pivotal element of the Dectin-2 and Dectin-1 signaling pathway, was not detected in wild-type (WT) APCs. On the other hand, we confirmed a glycan-dependent binding of hemocyanins to chimeric TLR4 in vitro. Indeed, DCs from mice deficient for MyD88-adapter-like (Mal), a downstream adapter molecule of TLR4, were partially activated by FLH, suggesting a role of the TLR pathway in hemocyanin recognition to activate APCs. TLR4 involvement was determined using a TLR4 blocking antibody in wild-type APCs, and also DCs from C3H/HeJ mice strain (non-functional for this receptor) and macrophages deficient for TLR4. In all these cultures, hemocyanin-induced proinflammatory cytokine secretion was impaired in comparison with respective controls. Furthermore, we showed that KLH and FLH induced ERK1/2 phosphorylation, a key event involved in the TLR4 signaling pathway. Taken together, these results suggest that TLR4 participates in the hemocyanin-mediated proinflammatory response in APCs, which could cooperate with MR to trigger the beneficial proinflammatory effect that drives the immune response towards a Th1 polarization.